Microbiología Diagnóstica

Tinción de Gram

Clasificación bacteriana según la estructura de la pared celular.

1. Fijación

La muestra bacteriana se fija a un portaobjetos, usualmente con calor.

2. Colorante Primario

Se aplica cristal violeta. Todas las bacterias se tiñen de púrpura.

Color:

3. Mordiente

Se añade yodo (Lugol), que forma un complejo insoluble con el cristal violeta, fijando el colorante.

Color:

4. Decoloración

Se aplica alcohol-acetona.

Gram +

La gruesa capa de peptidoglicano se deshidrata, atrapando el colorante púrpura.

Gram -

La membrana externa y la delgada capa de peptidoglicano se disuelven, perdiendo el colorante.

5. Contracolorante

Se aplica safranina.

Resultado Gram +

Permanecen de color púrpura.

Color:

Resultado Gram -

Toman el colorante rosa/rojo.

Color:

Tinción de Ziehl-Neelsen

Identificación de Bacilos Ácido-Alcohol Resistentes (BAAR).

Dibujo de un Mechero Bunsen para fijación por calor

1. Fijación

Una muestra (p. ej., esputo) se extiende y se fija en un portaobjetos de vidrio, generalmente con calor.

Color:

2. Colorante Primario

Se aplica fucsina fenicada (carbolfucsina) y se calienta suavemente para que el colorante penetre la capa cerosa de lípidos (ácidos micólicos).

Color:

3. Decoloración

Se utiliza una solución de alcohol-ácido para lavar el colorante primario.

Ácido-Alcohol Resistente

Bacterias como Mycobacterium resisten la decoloración y retienen la fucsina.

No Ácido-Alcohol Resistente

Otras bacterias y células pierden el colorante y se vuelven incoloras.

4. Contracolorante

Se aplica azul de metileno para teñir las células que fueron decoloradas.

Resultado Final BAAR

Permanecen de color rojo/fucsia.

Color:

Rojo

Resultado Final No BAAR

Se observan de color azul.

Color:

Azul

Cultivo de Bacterias

Crecimiento de bacterias en medios nutritivos para su identificación.

Procedimiento Paso a Paso

1. Inoculación: Una muestra se inocula asépticamente sobre o dentro de un medio de cultivo (p. ej., sembrada por estría en una placa de agar sólido).

2. Incubación: El medio se incuba en condiciones controladas (p. ej., 35-37°C, atmósfera específica) durante 18 a 48 horas.

Observación de colonias en placa de Petri

3. Observación: Se observa el crecimiento. En medios sólidos, esto aparece como colonias distintas con características observables.

Tipos de Medios y Justificación

1. Medios Enriquecidos

Contienen nutrientes adicionales (p. ej., sangre) para soportar el crecimiento de organismos fastidiosos (exigentes).

Agar Sangre: Revela patrones de hemólisis (alfa, beta, gamma) para clasificar Streptococcus.
Agar Chocolate: Libera factores de crecimiento (X y V) necesarios para Haemophilus influenzae.

2. Medios Selectivos y Diferenciales

Aíslan grupos específicos de muestras mixtas e identifican características bioquímicas.

Agar MacConkey

Selectivo para Gram negativos: Sales biliares y cristal violeta inhiben Gram positivos.

Diferencial por fermentación de lactosa:
• Colonias rosadas/rojas: Fermentadoras de lactosa (p. ej., E. coli, Klebsiella).
• Colonias incoloras: No fermentadoras (p. ej., Salmonella, Shigella).

Agar Manitol Salado (Chapman)

Selectivo para Staphylococcus: La alta concentración de sal inhibe a otras bacterias.

Diferencial por fermentación de manitol:
• Medio vira a amarillo: Fermentador de manitol (S. aureus).
• Medio permanece rojo/rosa: No fermentador (S. epidermidis).

Positivo:

Negativo:

3. Medios para Anaerobios

Requieren un ambiente libre de oxígeno (p. ej., jarras de anaerobiosis) para cultivar anaerobios estrictos como Clostridium y Bacteroides.

Caracterización Bioquímica

Identificación basada en capacidades metabólicas y perfiles enzimáticos.

Prueba de la Catalasa

Detecta la enzima catalasa, que descompone H₂O₂ en H₂O y O₂ (burbujeo).

Justificación: Esencial para diferenciar Staphylococcus (Catalasa +) de Streptococcus (Catalasa -).

Prueba de la Coagulasa

Detecta la enzima coagulasa, que convierte el fibrinógeno en fibrina, causando la coagulación del plasma.

Justificación: Diferencia Staphylococcus aureus (Coagulasa +) de estafilococos coagulasa-negativos (p. ej., S. epidermidis).

Prueba de la Oxidasa

Detecta la citocromo c oxidasa, una enzima de la cadena de transporte de electrones.

Justificación: Diferencia Enterobacteriaceae (Oxidasa -) de otros bacilos Gram negativos como Pseudomonas y Neisseria (Oxidasa +).

Agar TSI (Triple Azúcar Hierro)

Medio diferencial que prueba la fermentación de glucosa, lactosa/sacarosa y la producción de gas/sulfuro de hidrógeno (H₂S).

Justificación: Crucial para la identificación de Enterobacteriaceae.

Pico Rojo / Fondo Amarillo + H₂S

(Alcalino/Ácido)

p. ej., Salmonella

Pico Amarillo / Fondo Amarillo + Gas

(Ácido/Ácido)

p. ej., E. coli, Klebsiella

Pico Rojo / Fondo Amarillo

(Alcalino/Ácido)

p. ej., Shigella

Tipificación Molecular

Métodos modernos que ofrecen alta especificidad y se están convirtiendo en práctica estándar.

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Amplifica secuencias de ADN específicas de un patógeno a partir de una muestra del paciente, permitiendo una detección rápida y sensible incluso con una cantidad mínima de material genético.

Secuenciación del Gen 16S ARNr

Considerado un estándar de oro para la identificación de especies bacterianas. La secuencia del gen 16S ARNr es altamente conservada pero tiene regiones variables que son únicas para cada especie, actuando como una huella genética precisa.

Perfiles de Patógenos Clave

Haz clic en una bacteria para ver su perfil diagnóstico completo.

S. aureus

S. pyogenes

S. pneumoniae

M. tuberculosis

P. aeruginosa

Neisseria spp.

Clostridium spp.

T. pallidum

Staphylococcus aureus

Microscopía: Cocos Gram positivos en racimos (como racimos de uvas).

Cultivo: Beta-hemólisis (lisis completa) en agar sangre; crece en Agar Manitol Salado, fermentando el manitol (colonias amarillas).

Bioquímica: Catalasa-positivo, Coagulasa-positivo. Esta combinación es altamente predictiva de S. aureus.

Streptococcus pyogenes (Grupo A)

Microscopía: Cocos Gram positivos en cadenas.

Cultivo: Beta-hemólisis en agar sangre.

Bioquímica: Catalasa-negativo. Sensible a la Bacitracina (un disco inhibe su crecimiento en agar).

Serología: La prueba de ASTO (antiestreptolisina O) detecta anticuerpos, indicando una infección reciente.

Streptococcus pneumoniae

Microscopía: Diplococos Gram positivos, lanceolados.

Cultivo: Alfa-hemólisis (lisis parcial verdosa) en agar sangre.

Bioquímica: Catalasa-negativo. Sensible a la Optoquina (un disco inhibe su crecimiento).

Mycobacterium tuberculosis

Microscopía: Bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) observados con la tinción de Ziehl-Neelsen. La tinción de auramina con fluorescencia es más sensible.

Cultivo: Crecimiento lento (semanas a meses) en el medio enriquecido de Lowenstein-Jensen. Sistemas automatizados (BACTEC) son más rápidos.

Prueba Inmunológica: La PPD (Mantoux) indica exposición previa o vacunación, no necesariamente enfermedad activa.

Pseudomonas aeruginosa

Microscopía: Bacilos Gram negativos.

Cultivo: No fermentador de lactosa en agar MacConkey. A menudo produce pigmentos (piocianina, color azul-verdoso) y un olor característico a uvas.

Bioquímica: Oxidasa-positivo (la distingue de las Enterobacteriaceae).

Neisseria spp.

Microscopía: Diplococos Gram negativos, arriñonados, a menudo vistos dentro de neutrófilos.

Cultivo: Requiere medios enriquecidos (Agar Chocolate) y selectivos (Thayer-Martin) con antibióticos.

Bioquímica: Oxidasa-positivo.

Clostridium spp.

Microscopía: Bacilos Gram positivos grandes. La formación de esporas es clave (tinción de Schaeffer-Fulton); su ubicación ayuda a diferenciar especies.

Cultivo: Anaerobios estrictos. C. perfringens muestra una doble zona característica de hemólisis en agar sangre.

Detección de Toxinas: El diagnóstico a menudo se confirma detectando la toxina específica (p. ej., Tetanospasmina), ya que aislar la bacteria puede ser difícil.

Treponema pallidum

Microscopía: Demasiado delgado para la tinción de Gram. Se observan espiroquetas móviles con microscopía de campo oscuro. Se usan tinciones de impregnación argéntica en tejidos.

Cultivo: No se puede cultivar en medios artificiales (excepción a los postulados de Koch).

Serología: Es el pilar del diagnóstico. Pruebas no treponémicas (VDRL, RPR) para cribado y seguimiento. Pruebas treponémicas (FTA-ABS) para confirmación.